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actividades anti-virus de herpes de la fracción bioactiva y aislada constituyente pura de Mallotus peltatus. un etnomedicina de Islas Andamán Abstracto Fondo Las infecciones virales, particularmente las infecciones causadas por el virus del herpes simple (VHS), representan uno de los más graves problemas de salud pública a nivel mundial debido a su impacto devastador. El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial antiviral del extracto crudo en metanol de un etnomedicina Mallotus peltatus. su fracción activa y el compuesto puro, contra HSV-1 y HSV-F 2 G. Resultado La citotoxicidad (CC 50. La concentración de toxicidad celular 50%), concentración eficaz antiviral (CE 50. La concentración requerida para lograr% de protección 50 contra el efecto citopático inducido por el virus), reducción de la placa y el índice de selectividad (SI, la relación de CC 50 y 50 CE) se determinó. Los resultados mostraron que el extracto metanólico crudo de M. peltatus poseía una débil actividad anti-HSV. y HSV-2 (CE 50 = 8,2 y, por el contrario, la fracción activa A y ácido ursólico aislado de la fracción A potente actividad antiherpesvirus tanto contra HSV-1 (SI = 22,3 y 20 CE 50 = 7,8 y 5,5 g / ml) mostraron 5,8 mg / ml, y si = 21,2 y 18,97). La fracción A y ácido ursólico aislado (10 g / ml) la formación de placa de HSV-1 y HSV-2 inhibieron en más de 80 niveles%, con una actividad antiviral dependiente de la dosis, en comparación con el aciclovir. El estudio de respuesta a tiempo reveló que la actividad anti-HSV de la fracción A y ácido ursólico aislado es más alta a 2-5 h después de la infección. Además, el estudio cinético de tiempo mediante el ensayo de inmunofluorescencia indirecta mostró un patrón característico de pequeños focos de células fluorescentes individuales en las células infectadas por virus de la fracción A - tratados en 2 h y 4 h después de la infección, lo que sugiere fármaco inhibe la difusión viral. Además, el estudio de PCR con cultivos de células infectadas tratadas con la fracción A y ácido ursólico aislado en diferentes intervalos de tiempo, no pudo demostrar la amplificación en 48-72 h, como el aciclovir tratado las células infectadas por el VHS. Por otra parte, la fracción A o ácido ursólico aislado mostraron ninguna interacción en combinación con aciclovir. Conclusión Este estudio reveló que la fracción bioactiva A y ácido ursólico aislado de M. peltatus tiene una buena actividad anti-HSV, probablemente mediante la inhibición de la primera etapa de multiplicación (post-infección de 0-5 h), con el valor SI de 20, lo que sugiere su potencial utilizar como agentes anti-HSV. Palabras clave Mallotus actividad antiviral peltatus Ethnomedicine El ácido ursólico virus del herpes simple Introducción Virus del herpes simple (HSV) son un patógeno humano común que causa herpes lábiles herpes genital. queratitis y encefalitis. La infección por HSV causada por tipo-1 (HSV-1) y tipo 2 (HSV-2) se transmite principalmente por contacto personal cercano, y el virus puede establece una infección latente de toda la vida en las neuronas sensoriales con lesiones recurrentes [1]. Herpes genital. por lo general causada por HSV-2, se extendió en silencio a través del sexo, da rienda suelta a un enorme daño económico y emocional debido a su potencial epidemia silenciosa, y puede causar una infección que amenaza la vida en las personas inmunodeprimidas y en recién nacidos [2]. Por otra parte, HSV-2 es un factor de riesgo alto para la adquisición de la infección por VIH [3. 4] y hay una relación sinérgica entre el VIH y HSV [5-7]. Un estudio reciente mostró que la terapia supresora del HSV-reducido en gran medida genitales y los niveles plasmáticos de ARN del VIH-1 en pacientes co-infectados [8]. Por lo tanto, el riesgo de adquirir o transmitir la infección por VIH se puede reducir en gran medida por la reducción de la propagación del herpes genital. uso clínico extenso y a largo plazo de los agentes anti-virus herpes como aciclovir, ganciclovir y sus derivados, foscarnet da como resultado efectos secundarios graves y los virus resistentes a los medicamentos [9 - 11]. Además, se informa de aciclovir a incorporar en el ADN celular, produciendo reacciones adversas a los medicamentos y, por tanto, inadecuado para mujeres embarazadas [12] y recién nacidos [13. 14]. Por otra parte, los principales determinantes de la inmunidad eficaz contra la infección por HSV aún no se identifica [15], y la eficacia de los animales no ha predicho el éxito en los seres humanos [16]. Además, las vacunas terapéuticas no inducir respuestas en anticuerpos específica para proteger a los receptores de recurrencias [15]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de no acoplamiento y agentes baratas, fácilmente disponibles, menos tóxicos alternativos para controlar y prevenir la infección por HSV y su transmisión. ethnomedicinal plantas ofrecer una alternativa potencial debido a su amplio uso en la medicina tradicional y algunas tienen potencial terapéutico prometedor [17]. Una de las medicina tradicional ampliamente utilizado Mallotus peltatus (Geist) Muell. Arg. (Euphorbiaceae), conocido como pataque y Obottacke por Onge y Kamala por la población local, es un arbusto endémico de panatropical los bosques del interior de Chidiyatappu, Baratang, jarawa Creek, y la entrevista Islas de Andamán. La decocción de hojas de M. peltatus es ampliamente utilizado en las poblaciones tribales de Islas de la Bahía, la India, para el tratamiento de la piel y dolencias intestinales [18], y dolor de estómago [19]. Sin embargo, hasta la fecha no hay ninguna validación científica de la utilización de esta etnomedicina. A medida que nuestro esfuerzo continuo para identificar el potencial terapéutico de la fuente de plomo etnomedicinal hemos evaluado varias ethnomedicines incluyendo M. peltatus para antimicrobiana [20], antiinflamatoria y actividades relacionadas con el [20 - 22]. Basado en el uso tradicional en infecciones de la piel el objetivo del presente trabajo es evaluar, por primera vez, la actividad in vitro antiviral del extracto metanólico crudo, fracción más activa, y el compuesto aislado (s) de la fracción activa de M . peltatus hoja. materiales y métodos Los materiales vegetales Las hojas de M. peltatus (Geist.) Muell. Arg. fue recogido de las selvas tropicales de Centro y Sur de Andaman (Chidiyatappu, Baratang y Jaroaw Creek), la India, durante todo el año. Las muestras de especímenes fueron identificados por el Dr. Sreekumar, Científico Senior de Botánica de la India (BSI), y depositadas en el Herbario de la Sección (Herbario Nº 9221) de la BSI, Andaman y Nicobar Circle, Port Blair, para futuras referencias. Las hojas se secaron por separado en sombra, pulverizado mediante un molino mecánico y pasado a través de tamiz de malla 40 para obtener el polvo fino. Preparación de extractos hojas secas en trozos grandes en polvo (980 g) se extrajeron con 95% de metanol durante 72 h a temperatura ambiente [23]. Se recogió el extracto, se filtró, y el disolvente se evaporó a sequedad bajo presión reducida en un evaporador rotatorio Eyela (Japón) a 40-45 ° C. El extracto concentrado se dividió en alícuotas en botellas de color ámbar y se mantienen en desecador para uso posterior. El rendimiento w / w del extracto preparado fue de 8,7 ± 0,21. fitoquímica y aislamiento químico Las pruebas preliminares fitoquímicos del extracto metanólico crudo se realizaron por el método de Pollock y Stevens [24]. Los extractos metanólicos crudo concentrado (40 g) se repartió entre n-butanol y agua, mientras que la parte acuosa se liofilizó a sequedad (≈32 g) y la parte disolvente se eliminó a presión reducida en un evaporador rotatorio a 45 ° C. La fracción de n-butanol, con un peso ≈ 35 g, después se purificó sobre gel de sílice (malla 60-120, SRL) por cromatografía en columna, y se eluyó con éter de petróleo (PE): PE: CHCl 3 mezcla (en proporción diferente) CHCl 3 . CHCl 3. mezcla de MeOH (en diferentes proporciones) y MeOH. Todas las fracciones eluidas se controlaron mediante cromatografía en capa fina (TLC) usando placas de aluminio pre-recubierta (E. Merck, Alemania). Dos de las principales fracciones condensadas A y B fueron aislados junto con una mezcla de compuestos de menor importancia en TLC. El compuesto principal aislada (s) se purifica a continuación por cromatografía en columna de gel de sílice repetida y se eluyeron por PE: CHCl3 (1: 1) y CHCl 3. MeOH (95: 5) mezcla para obtener el compuesto puro. El análisis espectral de compuestos aislados de la fracción A y B se realiza por IR (JASCO-FTIR espectrofotómetro en discos de bromuro de potasio), de masa (JEOL JMS600 Espectrómetro de Masas) y (espectrómetro Bruker DPX-300 RMN en DMSO-d 6 solución) RMN. La identificación se realizó también por el Co-TLC, y superponibles IR con muestras auténticas. Los puntos de fusión se comprobaron en un aparato de punto de fusión mediante muestras mixtas, es decir, ácido ursólico auténtico y aislada y β-sitosterol [20. 23]. Los virus y la línea celular células de riñón de mono verde africano (células Vero, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) se cultivaron y mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM), suplementado con suero de 5 a 10% de bovino fetal (FBS) [25]. La cepa estándar VHS-2 G (ATCC-734) y HSV-1 F (ATCC-733), adquirido a la ATCC, se utilizaron. Después de purificación en placa, el virus se cultivó y las reservas de virus se almacenaron a -80 ° C para uso futuro [26], y siempre que sea necesario las reservas de virus se cultivaron en células Vero para determinar los títulos y se utiliza para el estudio adicional. ensayo de citotoxicidad toxicidad de la célula se controló mediante la determinación del efecto del extracto metanólico crudo, su fracción bioactiva A y ácido ursólico aislado en la morfología celular [27]. células Vero se cultivaron en placa de 96 pocillos a 1,0 x 10 5 células / ml. Diferentes concentraciones de extracto metanólico crudo / fracción A / ácido ursólico aislado y aciclovir medicamento estándar se añadieron a cada pocillos de cultivo en un volumen final de 100 l, por triplicado, con DMSO (0,1%) como un control negativo. Después de incubación a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 2 días, se añadió reactivo MTT (10 l) a cada pocillo. Después de 4 h de incubación a 37 ° C, el formazano se solubilizó mediante la adición de HCl diluido (0,04 N) en isopropanol, y la absorbancia se leyó a 570 nm con una longitud de onda de referencia de 690 nm por un lector ELISA. Los datos se calcularon como el porcentaje de viabilidad celular utilizando la fórmula: [(absorbancia de la muestra - libre de células de la muestra en blanco) / media absorbancia media de control)] / 100%. Se determinó la concentración citotóxica 50% (CC 50) que provoca cambios morfológicos visibles en 50% de las células Vero con respecto al control celular [26. 28]. ensayo antiviral La actividad antiviral de extracto metanólico crudo, la fracción A y el ácido ursólico aislado contra HSV-1 y HSV-2 se evaluó mediante el ensayo de MTT [29]. células Vero se sembraron en placas de 96 pocillos con una concentración de 1,0 x 10 5 células / ml. Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 6 h, se añadió el virus (0,5 MOI) y se incubó durante 1 h. Diferentes concentraciones de extracto / fracción A ácido metanólico crudo / aislados ursólico se añadieron a pocillos de cultivo por triplicado en un volumen final de 100 l en cada pocillo. La concentración máxima de DMSO (0,1%) se utilizó como control negativo y el aciclovir como control positivo durante todo el estudio. Después de 3 días de incubación a 37 ° C en 5% de CO 2. la prueba MTT se llevó a cabo como se describe anteriormente. tasa de inhibición viral se calculó como: [(A cv televisión - A) / (A cd - A cv)] / 100%. Una televisión indica la absorbancia del extracto / fracción A de ácido crudo metanólico / ursólico con células infectadas por virus. A cv y un CD indican la absorbancia del control de virus y la absorbancia del control celular. La concentración antiviral de 50% de eficacia (CE 50) se definió como la concentración que logra una inhibición del 50% de los efectos citopáticos inducidos por virus. La cantidad de virus utilizada en cada experimento se basa en las células diana infectadas de 0,5 MOI, tanto para los virus para producir productos de 50% de formazan de MTT como en las células de control no infectadas [30]. ensayo de dosis-respuesta Para analizar el efecto dependiente de la dosis de los fármacos de ensayo en células Vero infectadas, se añadieron diferentes concentraciones de la fracción A o ácido ursólico aislado a HSV-1 y HSV-2 de cultivo de células Vero infectadas por triplicado. Después de 2-3 días de ensayo MTT se llevó a cabo para determinar la inhibición de la infección causada por el VHS, como se describe anteriormente [30. 31]. ensayo de placa viral ensayo de reducción de placa se utilizó para evaluar la actividad antiviral de la fracción A o ácido ursólico aislado y para comparar su actividad con aciclovir. Este ensayo evaluó la eficacia del agente de ensayo sobre la inhibición de la infección de células Vero por las partículas libres de virus y de ese modo el número de placas virales formadas en monocapa de células, ya que cada partícula viral no neutralizado por el agente de ensayo se infectar las células y formó una placa. Diluciones seriadas de la fracción A o ácido ursólico aislado en EMEM se añadió a las células infectadas (MOI: 0,5 de HSV-1 o HSV-2) y se incubaron a temperatura ambiente, antes de la adición a las células. Después de 1-2 h de incubación a 37 ° C, las células se lavaron con EMEM fresco y recubiertos de metilcelulosa, por lo que el virus puede propagarse a través de la ruta de célula a célula para formar placas. Las placas que se desarrollaron después de 2-3 días de incubación se tiñeron con cristal violeta. La concentración eficaz de la fracción A de ácido ursólico / aislado que inhibió el número de placas virales en un 50% (CE 50) se interpoló a partir de las curvas de dosis-respuesta [30. 31]. ensayo de tiempo de respuesta ensayo de respuesta de tiempo se utilizó para investigar el mecanismo de inhibición de la infección de HSV por la fracción A ácido ursólico / aislados en diferentes períodos de tiempo de hasta 24 h. células Vero a 1,0 x10 se cultivaron 5 células / ml en placas de 96 pocillos a 37 ° C en 5% de CO 2. Después de tres enfoques diferentes del virus (0,5 MOI) fue expuesta a las diferentes concentraciones de la fracción A o ácido ursólico aislado antes de infectar la célula vero (pre-infección); durante la infección de células Vero (co-infección); y después del cultivo de células Vero se infectaron con el virus (después de la infección) en diferentes intervalo de tiempo, por triplicado, con DMSO (0,1%) y el aciclovir como control negativo y positivo, respectivamente. Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 2-3 días, la prueba MTT se llevó a cabo como se describe anteriormente [31]. Inmunofluorescencia (IFA) Estudio de la fracción A tratada células infectadas por VHS células Vero infectadas con HSV monocapa tratados con diferentes concentraciones de la fracción A se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) para eliminar los restos celulares. Después las células se fijaron con para-formaldehído (4%) y se bloquearon con albúmina de suero bovino 1% (BSA) en solución X100 PBS-Triton 0,1%. Las células se lavaron con PBS, y luego se permeabilizaron con 0.1% de Triton X100 en PBS, y se incubaron durante la noche con anticuerpos marcados con FITC anti-HSV-1 monoclonales de ratón (Dako Cytomation, Dinamarca). Después de lavar con PBS, se añadieron secundario de conejo anticuerpos policlonales (Dako Cytomation, Dinamarca) y DAPI, y se observaron las células bajo microscopio de epifluorescencia [32]. La amplificación de ADN viral aislado de las células infectadas tratadas con la fracción A ácido ursólico / aislado por PCR HSV-1 infecta cultivos de células Vero, se trató con la fracción A ácido ursólico / aislados en diferentes intervalos de tiempo (0, 48, 72 h) fueron cosechadas. El ADN viral se extrae a partir del fluido de cultivo de tejidos usando QIAmp MiniElute Kit Virus spin (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), se sometió a PCR usando cebadores específicos de HSV-1 de tipo [33]. planta de drogas extrae la interacción La actividad antiviral de la fracción A o ácido ursólico aislado, en combinación con aciclovir, se evaluó frente a HSV-1 y HSV-2 (MOI 0,5) mediante el ensayo de MTT, con el objetivo de saber si esta combinación puede aumentar la eficacia antiviral. El efecto combinado de aciclovir y la fracción A o ácido ursólico aislado en HSV-1 replicación se analizó por isobolograma método [34-36]. Aquí, la CE 50 se utilizó para calcular la concentración inhibidora fraccional (FIC) de los agentes en combinación. La interacción entre la fracción A o ácido ursólico aislado y el aciclovir se interpreta de acuerdo con el índice combinado FIC [extracto de FIC / + compuesto aciclovir FIC como sinergia (≤0.5), sin interacción (0,5-4) o antagonismo (4) [37]. análisis estadístico El índice selectivo (SI), un marcador de la actividad antiviral, se determinó como la relación de CC 50 a 50 EC. Los estadísticamente diferentes efectos de extracto crudo metanólico / fracción A o ácido ursólico aislado y acyclovir sobre la inhibición de HSV se compararon con el grupo de control, así como entre la fracción A o ácido ursólico aislado, usando la prueba t de Student. Mientras que el efecto dependiente de la dosis de la actividad antiviral se determinó por regresión lineal. resultados El análisis espectral de compuestos aislados de la fracción A y la fracción B Los datos espectrales (IR, RMN y de masas) y puntos de fusión de compuestos aislados de la fracción A y B fueron idénticos con ácido ursólico y β-sitosterol, respectivamente. Los espectros de IR del compuesto aislado a partir de la fracción A (Figura 1 A) de acuerdo bien con la muestra auténtica de ácido ursólico (Figura 1 B). El espectro mostró banda de absorción a 3.458 y 1.696 cm -1 indica la presencia de grupos hidroxilo y carboxilo; mientras que la banda en 1033 y 996 cm-1 indica enlace - C-OH, y otro pico a 2929 cm-1 se deriva de los enlaces C-H. IR, 1H-RMN y espectros de masas del compuesto aislado de la fracción A con ácido ursólico auténtico. El extracto metanólico crudo concentrado se repartió entre n-butanol y agua. La parte acuosa se liofilizó mientras que la parte de disolvente se evaporó por Eyela (Uni trampa UT 1000, Japón) evaporador rotatorio a 45 ° C. La fracción de n-butanol se purificó en columna de gel de sílice, y se eluyó con PE: PE: CHCl 3. CHCl 3. MeOH y MeOH. Las fracciones eluidas, se observó por TLC, produjo dos fracciones principales condensados ​​A y B. Se purificó el compuesto aislado (s) a partir de la fracción A continuación, mediante columna de gel de sílice repetida y se eluyó con PE: CHCl3 (1: 1) y CHCl 3. MeOH (95: 5) mezcla para obtener el compuesto puro. Los espectros de IR de compuestos aislados de la fracción A realizado por JASCO-FTIR espectrofotómetro en discos de bromuro de potasio [A] de acuerdo bien con la muestra auténtica de ácido ursólico [B]. El espectro de 1H RMN de compuesto aislado a partir de la fracción A por el espectrómetro Bruker DPX-300 RMN en solución de DMSO-d 6 [C] indica que el compuesto aislado fue casi idéntica a la muestra auténtica de ácido ursólico [D]. Los espectros de masas de compuesto aislado a partir de la fracción A, determinado por JEOL JMS600 Espectrómetro de Masas [E] indica que el compuesto es ácido ursólico. El espectro de 1H RMN del compuesto aislado a partir de la fracción A en DMSO-d 6. mostró la señal a 11,92 indica un grupo - COOH en 28 ª posición. Mientras que la señal en δ3.3 está de acuerdo con la presencia de - CH-OH en 3 rd posición, y - OH en δ4.29 pico. Señal en δ5.12 significa la presencia de un enlace doble trisustituido (insaturación) y los siete - CH 3 grupos entre δ0.6 y 1,3. Las posiciones de cambio del compuesto aislado eran casi idéntica a la muestra auténtica de ácido ursólico (Figura 1 C, 1 D). Los espectros de masa del compuesto aislado a partir de la fracción A mostró pico prominente en mlz 248, y otros picos a mlz 207, 203 y 189 indica que el compuesto es ácido ursólico (Figura 1 E). El punto de compuesto aislado de fusión es 285-287 ° C, similar a la muestra auténtica de ácido ursólico. El espectro IR del compuesto aislado a partir de la fracción B muestra bandas de absorción a 3426 y 1056 cm-1 indica la presencia del grupo - OH. Otros picos prominentes estaban en 2935, 2852, 1706 y 1462 cm-1 derivada del esqueleto de hidrocarburo. La banda de absorción a 965 y 802 cm -1 se debe al grupo C = C-H (Figura 2 A, 2 B). El espectro 1H NMR del compuesto aislado de la fracción B muestra el cambio en δ3.53, indicando grupo CH-OH en la posición C3. El protón olefínico a las 6 ª posición tiene pico en δ5.34 y el grupo de seis - CH3 apareció entre δ0.6-1.03 regiones. Otros protones aparecieron entre δ1.0 - 2,3. La posición de cambio indica que el compuesto aislado fue casi idéntica a la muestra auténtica de β-sitosterol (Figura 2 C, 2 D). Los espectros de masa de compuesto aislado tenía el pico a mlz 414 (M +) con picos significativos de iones fragmento en mlz 396, 382, ​​273 255, 231, y 213. El intenso pico con mayor número de masa en mlz 414 se debe al ion molecular de origen β-sitosterol (Figura 2 E). A menos intenso alrededor de 400 mlz significa la presencia de su homólogo inferior (campesterol) en pequeña cantidad. El punto de fusión para el compuesto aislado fue 136-137 ° C, similar a la ß-sitosterol muestra auténtica. IR, 1H-RMN y espectros de masas del compuesto aislado de la fracción B con auténtica β-sitosterol. El extracto metanólico crudo concentrado se repartió entre n-butanol y agua. La parte acuosa se liofilizó mientras que la parte de disolvente se evaporó por Eyela (Uni trampa UT 1000, Japón) evaporador rotatorio a 45 ° C. La fracción de n-butanol se purificó en columna de gel de sílice, y se eluyó con PE: PE: CHCl 3. CHCl 3. MeOH y MeOH. Las fracciones eluidas, se observó por TLC, produjo dos fracciones principales condensados ​​A y B. Se purificó el compuesto aislado (s) de la fracción B a continuación, mediante columna de gel de sílice repetida y se eluyó con PE: CHCl3 (1: 1) y CHCl 3. MeOH (95: 5) mezcla para obtener el compuesto puro. Los compuestos aislados de los espectros IR de la fracción B realizado por JASCO-FTIR espectrofotómetro en discos de bromuro de potasio [A] de acuerdo bien con la muestra auténtica de β-sitosterol [B]. El espectro de 1H RMN de compuesto aislado a partir de la fracción B por el espectrómetro Bruker DPX-300 RMN en solución de DMSO-d 6 [C] indica que el compuesto aislado fue casi idéntica a la muestra auténtica de β-sitosterol [D]. Los espectros de masas del compuesto aislado de la fracción B. determinada por JEOL JMS600 Espectrómetro de Masas [E] indicó que el compuesto es ß-sitosterol. Evaluación de la citotoxicidad y la actividad anti-HSV mediante ensayo de MTT en células Vero Se utilizó el ensayo MTT para determinar la toxicidad de los agentes ensayados. Los resultados revelaron que el extracto metanólico crudo de M. peltatus. su fracción A y ácido ursólico aislado exhibieron un efecto citotóxico sobre las células Vero a concentraciones superiores a su CE 50. Los resultados presentados en la Tabla 1 revelaron que el CC 50 de extracto metanólico crudo, la fracción A y ácido ursólico aislados fueron 452 g / ml, 174 mg / ml y 110 mg / ml respectivamente. La actividad anti-HSV probado mediante el ensayo MTT demostraron que el extracto metanólico crudo, la fracción A y el ácido ursólico aislado tenían actividad anti-HSV en diferente nivel de dosis, en función de su valor y selectividad CE 50 de índice (SI). La CE 50 de la fracción A (7,8 ± 1,6 y 8,2 ± 1,8), y ácido ursólico aislado (5,5 ± 0,54 y 5,8 ± 1,1) contra HSV-1 y HSV-2 revelaron la más fuerte actividad anti-HSV, en comparación con el metanólico crudo extraer (p 0,0001). Además, la CE 50 y el índice de SI indicaron que la fracción A y aislada de ácido ursólico fue más activo contra el VHS-1 de HSV-2. En el otherhand, fracción B tenía CC 50 y CE 50 en una concentración más alta con un índice muy bajo SI, lo que indica su inactiveness, en comparación con aciclovir (Tabla 1). Evaluación de la actividad anti-HSV de M. peltata extracto metanólico crudo y sus constituyentes por ensayo MTT una La concentración citotóxica 50% para las células Vero en g / ml. b Concentración del compuesto (g / ml) produce una inhibición del 50% de virus inducida CPE de tres experimentos separados. c índice de selectividad (IS) = CC 50 / CE 50. Dosis-efecto de la fracción A / ácido ursólico Para analizar la actividad antiviral dependiente de la dosis se utilizaron diferentes concentraciones de la fracción A, ácido ursólico aislado, junto con aciclovir y DMSO (0,1%) como control positivo y negativo, respectivamente, en HSV-2 células Vero infectadas por VHS-1 y. Los resultados presentados en la Figura 3 A, mostraron que la fracción A a 14,5 mg / ml ácido ursólico y aislado en 9,0 mg / ml mostraron casi el 100% de inhibición contra HSV-1. Un efecto similar se observó una brecha entre AT y 15 ácido ursólico aislado en 12,5 g / ml contra HSV-2 (Figura 3 B), lo que indica una alta correlación entre la concentración del fármaco y la velocidad de inhibición. actividad dependiente de la dosis de ácido ursólico aislado o fracción-A y el aciclovir en HSV-1 [A] y HSV-2 [B]. Diferentes concentraciones de la fracción A. ácido ursólico aislado o aciclovir (2,5-15 mg / ml) se añadieron a HSV-1 y HSV-2 (negro, gris y barras blancas) infectaron células Vero después de 1 h de infección. porcentaje de inhibición se evaluó mediante el ensayo MTT después de 3 días de incubación a 37 ° C. Cada barra representa la media ± E. E.M de tres experimentos independientes. Evaluación del ensayo de reducción de placas ensayo de reducción de placa también se utiliza para acceder a la actividad antiviral de la fracción A, y ácido ursólico aislado, usando aciclovir y DMSO (0,1%) como control positivo y negativo respectivamente. Los resultados revelaron que tanto la fracción A y ácido ursólico aislado en una concentración de 5 a 100 mg inhibió la formación de placa ml / por HSV-1 y HSV-2, lo que indica su actividad inhibidora dependiente de la dosis (Figura 4). El aciclovir fármaco de control mostró 100% de inhibición de la formación de placa en 10 g / ml, mientras que no se observó inhibición con 0,1% de DMSO (datos no mostrados). ensayo de reducción de placa de HSV-1 [A] y HSV-2 [B] con la fracción A, ácido ursólico aislado y aciclovir. Diferentes concentraciones de la fracción A. ácido ursólico aislado o aciclovir (5-100 mg / ml) se añadieron a HSV-1 y HSV-2 (negro, gris y barras blancas) infectaron células Vero. Después de 1-2 h de incubación a 37 ° C se recubrieron las células con metilcelulosa y las placas se desarrollaron después de 2-3 días de incubación se tiñeron con cristal violeta. La inhibición número de placa se calculó, y la concentración efectiva de la fracción A / ácido ursólico aislado que inhibió el número de placas virales se interpoló a partir de la curva dosis-respuesta. tiempo de análisis de la fracción A y ácido ursólico o aislado tiempo de análisis se realizó con la fracción A o ácido ursólico aislado para investigar el mecanismo de la actividad antiviral. La inhibición se evaluó mediante el ensayo MTT después de 3 días de la infección y se expresó como porcentaje de inhibición. El resultado mostró que la fracción A a 7,8 y 14,5 mg / ml inhibió HSV-1 (Figura 5 A) y HSV-2 (Figura 5 B) significativamente (p 0,001) dentro de 2-5 h después de la infección, es decir, durante el período temprano de la multiplicación del virus. Considerando que no se encontró una inhibición cuando el virus se expuso a la fracción A o ácido ursólico aislado antes de la infección (antes de la infección) o juntos (co-infección), hasta la concentración más alta probada. Efecto inhibidor de la fracción A durante la pre-infección, co-infección y después de la infección en HSV-1 [A] y HSV-2 [B]. Diferentes concentraciones de la fracción A [7.8 g / ml (cuadrados), y 14,5 mg / ml (triángulo)] se añadieron con el HSV-1 y HSV-2 células Vero infectadas en varios período de tiempo como pre-infección (-1 h) , co-infección (0 h) o después de la infección (1-24 h). Después de 3 días de incubación a 37 ° C, la inhibición se evaluó mediante el ensayo de MTT y se expresó como el porcentaje de inhibición. Cada barra representa la media ± E. E.M de tres experimentos independientes. estudio de inmunofluorescencia (IFA) con la fracción A tratada células infectadas por VHS Se usó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para determinar la cinética de la fracción más activa A en la expresión de antígenos de HSV-1 F. El HSV-1 F células Vero infectadas fueron tratadas con diferentes concentraciones de la fracción A y se incubaron durante diferentes intervalos de tiempo. Los resultados revelaron menor número de partículas de virus en células Vero tratadas con la fracción A, que indica la fuerte actividad anti-HSV. La expresión del antígeno HSV mostró un patrón característico de pequeños focos de solo fluorescente en la fracción A HSV-1 en las células infectadas tratado en diferente intervalo de tiempo (2-4 h después de la infección), lo que sugiere difusión viral inhibe fármaco (Figura 6). Además, la actividad antiviral de la fracción A es más evidente en su concentración más alta (14,5 mg / ml) a prueba. estudio de inmunofluorescencia de HSV-1 infecta células Vero tratadas con la fracción-A durante 2-4 h después de la infección. Control de las células Vero [A]; Las células tratadas con la fracción A (14,5 mg / ml) durante 2 h [B] y 4 h [C]; control del virus a las 2 h después de la infección [D]; las células infectadas por el virus tratado con la fracción A en 7,8 g / ml [E] y 14,5 g / ml [F] a las 2 h después de la infección; Virus Control a las 4 h después de la infección [G]; células infectadas con el virus tratado con la fracción A en 7,8 mg / ml [H] y 14,5 mg / ml [I] en 4 h post-infección. La amplificación de ADN viral aislado a partir de HSV-1 infecta células Vero tratadas con la fracción A o aislada de ácido ursólico por PCR Para comparar el efecto sobre la replicación viral, la amplificación de ADN de HSV infectan y HSV-1 se detectó por PCR fracción A o ácido ursólico aislado y aciclovir tratados. Los resultados demostraron que la fracción A de ácido ursólico / aislado tratado HSV-1 (MOI 0,5) los cultivos en 24 a 72 h de duración no pudieron demostrar ninguna amplificación, similar al aciclovir (control de drogas) cultivos tratados. Mientras HSV-1 cultivo infectado (control) mostraron amplificación clara de ADN viral en gel de agarosa al 1% a las 48 h y 72 h (Figura 7). Además, en las células infectadas, la amplificación del gen pol (control interno) indicó que la integridad del gen. La detección de HSV-1 de ADN en la fracción A de ácido ursólico / o culturas aciclovir tratados y no tratados por PCR. Carril 1: Marcador de 100 pb; Carril 2: control de PCR; Carril 3: control de la célula; Carril 4: Célula + fracción A; Carril 5: Célula + aciclovir; Carriles 6: control positivo (HSV-1 después de 72 h); Carril 7: Célula + VHS-1 después de 48 h; Carril 8: células + HSV-1 (MOI: 0,5) + fracción A (14,5 mg / ml); Carril 9: células + HSV-1 (MOI: 0,5) + ácido ursólico aislado (9 mg / ml); Carril 10: Célula + HSV-1 (MOI: 0,5) + aciclovir (5 mg / ml). planta de drogas extrae la interacción Para evaluar si la fracción A y o ácido ursólico aislado puede capaz de aumentar la eficacia inhibidora de aciclovir en combinación, hemos probado la fracción A-aciclovir y combinación aislado ursólico ácido-aciclovir (sinergismo) mediante el ensayo de MTT, con el isobolograma método. Nuestros resultados demuestran que las CE 50 de la fracción A, ácido ursólico aislado y el aciclovir fue de 7,8, 55 y 2,1 g / ml, respectivamente, pero en combinación con aciclovir la media CE 50 era 2,7 y 2,51 g / ml, respectivamente. Por otra parte, el índice FIC de 0,78 (entre el aciclovir y la fracción A) y 0,84 (entre aciclovir y ácido ursólico aislado), indicó que no hubo interacción sinérgica entre ellos (Tabla 2). Además, ninguna de estas combinaciones exhibió efecto citotóxico contra células Vero (datos no mostrados). Efectos de la fracción A ácido ursólico / aislados en combinación con aciclovir en HSV-1 F infectaron células Vero b FIC fracción / + compuesto aciclovir FIC FIC son de fracción / compuesto y el aciclovir, respectivamente. Discusión El presente estudio, por primera vez, demuestra la actividad anti-HSV de extracto metanólico crudo de M. hoja peltatus, una de las tribus etnomedicina Onge de Andaman y Nicobar, India. estudio fitoquímico reveló que el extracto metanólico crudo contiene dos fracciones principales, la fracción A y B, de los cuales la fracción A tenía significativa actividad anti-HSV. La separación cromatográfica y análisis espectral reveló que la fracción A contiene un ácido ursólico triterpeno conocido, que posee una fuerte actividad antiviral contra HSV-1 y HSV-2 in vitro. La actividad antiviral del extracto metanólico crudo fue débil en comparación con la fracción A, probablemente debido a sus bajas concentraciones de compuesto (s) bioactivo. Mientras que la mayor actividad antiviral de la fracción A, que el extracto metanólico crudo, es debido a la mayor concentración de compuestos bioactivos dentro de la fracción. A principios de estudiar con el extracto metanólico crudo de M. peltatus mostró antibacteriana y antifúngica moderada [20], analgésica y antiinflamatoria [20. 21. 38] actividad. En la fracción otherhand B no mostró ninguna actividad anti-HSV, por lo tanto, no se incluye en un estudio adicional. abreviaturas Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen intereses en competencia. Las afiliaciones de los autores referencias PubMed J Am Acad Dermatol. N Engl J Med. PubMed N Engl J Med. Arch Intern Med. Am J Ophthalmol. Ver artículo PubMed Ver artículo Ver artículo J Ethnopharmacol. Ver artículo J Ethnopharmacol. Lanceta. Ver artículo Am J Chin Med. J Antimicrob Chemother. Ver artículo Res antivirales. Res antivirales. Antimicrob Agents Chemother. J Antimicrob Chemother. Phytomedicine. PubMed Vol. Ver artículo PubMed Ver artículo Phytomedicine. FEBS Lett. Ver artículo PubMed Biol Pharm Bull. Derechos de autor Este artículo se publica bajo licencia de BioMed Central Ltd Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento (creativecommons. Org / licencias / por / 2. 0), que permite sin restricciones uso, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original es debidamente citados.